Atg3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403308-ACT

O ATG3 humano codifica a Atg3, uma enzima do tipo E2 essencial para a autofagia por catalisar a lipidização de LC3/ATG8 e promover o alongamento da membrana do autofagossomo. Atuando a jusante de ATG7, a Atg3 favorece a conjugação de LC3 à fosfatidiletanolamina e integra sinais de sensoriamento de nutrientes que coordenam a proteostase, o controle de qualidade de organelos e a adaptação ao estresse. A autofagia dependente de ATG3 desregulada tem sido associada a alterações na homeostase mitocondrial, na sinalização inflamatória e em programas de sobrevivência celular relevantes para a biologia do câncer e a neurodegeneração. Como um efetor central da autofagia, o ATG3 é frequentemente estudado para dissecar o fluxo da via, mecanismos de autofagia seletiva e a comunicação cruzada com a apoptose e vias da imunidade inata.

Atg3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ATG3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Atg3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ATG3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ATG3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Atg3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ATG3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Atg3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Atg3 em células tumorais com expressão de ATG3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.