ASS1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401923-ACT

A ASS1 humana (argininosuccinato sintase 1) codifica uma enzima citosólica que catalisa a condensação dependente de ATP de citrulina e aspartato para formar argininosuccinato, uma etapa central do ciclo da ureia e da biossíntese de arginina. Ao regular a eliminação de nitrogênio e a disponibilidade de arginina, a ASS1 influencia a homeostase celular de aminoácidos, o metabolismo do óxido nítrico e a síntese downstream de poliaminas. A expressão alterada de ASS1 está associada a disfunções hereditárias do ciclo da ureia e pode remodelar dependências metabólicas em células tumorais, nas quais frequentemente se observam auxotrofia por arginina e reprogramação do metabolismo de um carbono e de nucleotídeos. Essas características tornam a ASS1 um alvo útil para estudar a regulação de vias metabólicas, respostas ao estresse nutricional e relações genótipo–fenótipo em modelos de células humanas.

ASS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ASS1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASS1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ASS1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ASS1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASS1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ASS1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASS1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASS1 em células tumorais com expressão de ASS1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.