ASC/TMS1/PYCARD Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-426209-ACT

Pycard codifica a ASC (também conhecida como TMS1/PYCARD), uma proteína adaptadora bipartida contendo os domínios PYD e CARD, que nucleia a montagem do inflamassoma em células mieloides e epiteliais. A ASC faz a ponte entre receptores de reconhecimento de padrões a montante, como NLRP3, AIM2 e NLRC4, e a pró-caspase-1, permitindo a ativação da caspase-1, a maturação de IL-1β e IL-18 e a execução da morte celular piroptótica. Em modelos murinos, a sinalização dependente de Pycard molda respostas imunes inatas a sinais de perigo microbianos e estéreis, influenciando cascatas de citocinas, recrutamento de leucócitos e lesão tecidual. A atividade desregulada do inflamassoma de ASC tem sido implicada em fenótipos inflamatórios e neuroinflamatórios, inflamação metabólica e alterações no microambiente imune associado a tumores, tornando Pycard um nó-chave para a investigação de vias.

ASC/TMS1/PYCARD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Pycard sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ASC/TMS1/PYCARD O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Pycard em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Pycard, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ASC/TMS1/PYCARD. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Pycard nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ASC/TMS1/PYCARD no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ASC/TMS1/PYCARD em células tumorais com expressão de Pycard silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.