ART1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403742-ACT

L’ART1 umano codifica l’ecto-ADP-ribosiltransferasi 1, un enzima di superficie cellulare ancorato tramite GPI che catalizza la mono-ADP-ribosilazione di proteine extracellulari e associate alla membrana utilizzando NAD+ come substrato. Questa modifica post-traduzionale può alterare la funzione dei recettori, l’adesione e la segnalazione immunitaria all’interfaccia cellulare, collegando ART1 alla regolazione della comunicazione cellulare e delle risposte allo stress. L’attività di ART1 è stata studiata nel contesto di microambienti infiammatori e di fenotipi associati al cancro, in cui cambiamenti nell’ADP-ribosilazione di superficie possono influenzare le interazioni tumore–sistema immunitario e il comportamento metastatico. In quanto mediatore della segnalazione extracellulare dipendente da NAD+, ART1 rappresenta un punto di accesso concreto per indagare come l’ADP-ribosilazione plasmi il crosstalk tra vie di segnalazione nelle cellule umane.

ART1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ART1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ART1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ART1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ART1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ART1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ART1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ART1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ART1 nelle cellule tumorali con espressione di ART1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.