Aquaporin 0/AQP0 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403852-ACT

MIP codifica a aquaporina 0 (AQP0), a principal proteína intrínseca de membrana das células de fibras do cristalino, que atua como um canal de água de baixa permeabilidade e como uma molécula de adesão que sustenta a justaposição íntima entre fibras. Ao regular a homeostase hídrica do cristalino e contribuir para a organização da membrana, a AQP0 ajuda a manter a transparência e as propriedades refrativas do cristalino por meio de processos ligados ao equilíbrio osmótico, à arquitetura das junções e à proteostase. Sua atividade é influenciada por modificações pós-traducionais e por interações com componentes do citoesqueleto e das junções do cristalino, que moldam a maturação das células de fibras. A desregulação ou mutação de MIP está associada a cataratas hereditárias e a defeitos na microarquitetura do cristalino, tornando-o relevante para estudos do desenvolvimento do cristalino, agregação proteica e fisiologia de barreiras.

Aquaporin 0/AQP0 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MIP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Aquaporin 0/AQP0 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MIP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MIP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Aquaporin 0/AQP0. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MIP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Aquaporin 0/AQP0 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Aquaporin 0/AQP0 em células tumorais com expressão de MIP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.