AP4A Hydrolase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407028-ACT

NUDT2 codifica a hidrolase humana de AP4A, uma enzima da família Nudix que hidrolisa a diadenosina tetrafosfato (Ap4A) e dinucleósidos polifosfatos relacionados, regulando assim os reservatórios intracelulares de nucleotídeos “alarmonas”. Ao controlar a renovação/turnover de Ap4A, a hidrolase de AP4A influencia a sinalização por nucleotídeos ligada a respostas celulares ao estresse, ao equilíbrio redox e à coordenação de programas transcricionais e proliferativos. A atividade de NUDT2 se cruza com vias mais amplas do metabolismo de purinas e da homeostase de nucleotídeos, que podem moldar o processamento de DNA/RNA e a dinâmica do ciclo celular. Metabolismo desregulado de dinucleósidos polifosfatos e padrões alterados de expressão de NUDT2 foram relatados em contextos associados a doenças, apoiando sua utilidade como um nó mecanístico para estudar sinalização adaptativa ao estresse em células humanas.

AP4A Hydrolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de NUDT2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AP4A Hydrolase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus NUDT2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição NUDT2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AP4A Hydrolase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus NUDT2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AP4A Hydrolase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AP4A Hydrolase em células tumorais com expressão de NUDT2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.