ANKFY1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406658-ACT

A ANKFY1 humana (ankyrin repeat and FYVE domain containing 1) codifica uma proteína adaptadora associada à membrana, implicada no tráfego endossomal e na dinâmica de endossomos precoces dependente de Rab5, por meio da interação do seu domínio FYVE com o fosfatidilinositol 3-fosfato. Ao coordenar a triagem de cargas, a reciclagem de receptores e a maturação dos endossomos, a ANKFY1 contribui para saídas de sinalização reguladas a partir de receptores internalizados e pode influenciar vias de homeostase celular ligadas à percepção de fatores de crescimento e nutrientes. O transporte endocítico desregulado é uma característica recorrente na biologia do câncer e na neurodegeneração, o que torna a ANKFY1 um ponto relevante para estudos mecanísticos de sinalização mediada por vesículas e proteostase. Sua arquitetura de domínios também permite investigar a ligação a fosfoinositídeos, interações proteicas mediadas por repetições de anquirina e a regulação específica por compartimento de complexos de tráfego.

ANKFY1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ANKFY1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ANKFY1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ANKFY1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ANKFY1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ANKFY1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ANKFY1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ANKFY1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ANKFY1 em células tumorais com expressão de ANKFY1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.