Amylase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400533-ACT

AMY2A codifica uma α-amilase pancreática secretada que inicia a digestão de carboidratos ao hidrolisar ligações glicosídicas α-1,4 no amido e no glicogênio da dieta, gerando maltose e oligossacarídeos. Sua expressão e secreção estão intimamente ligadas à diferenciação do pâncreas exócrino e à biologia da via secretória regulada, integrando programas transcricionais responsivos a nutrientes com o tráfego de grânulos de zimogênio. Alterações na produção de amilase são comumente usadas como uma leitura funcional do estado acinar pancreático e da homeostase de enzimas digestivas, e AMY2A é estudado em contextos em que a função exócrina está comprometida, incluindo inflamação pancreática e disfunções mais amplas na regulação de enzimas digestivas. Como uma enzima secretada altamente expressa, AMY2A também serve como um lócus modelo para investigar o controle transcricional de proteínas secretadas e a identidade de células acinares.

Amylase 2a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMY2A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Amylase 2a O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMY2A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMY2A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Amylase 2a. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMY2A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Amylase 2a no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Amylase 2a em células tumorais com expressão de AMY2A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.