Amphiphysin II Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401263-ACT

BIN1 codifica a anfifisina II, uma proteína de remodelação de membrana contendo domínio BAR, que coordena a endocitose mediada por clatrina, a biogênese dos túbulos T e eventos de tráfego dependentes de curvatura por meio de interações com a dinamina e membranas ricas em fosfoinositídeos. A anfifisina II auxilia a formação de vesículas e a organização do citoesqueleto, com funções dependentes do contexto na atividade sináptica neuronal e na arquitetura de membrana do músculo. Alterações na expressão e no splicing de BIN1 têm sido associadas a vias relevantes para a miopatia miotubular e a degeneração neuromuscular, e BIN1 também é estudado em mudanças na rede endocítica observadas na biologia de doenças neurodegenerativas. Essas funções tornam BIN1 um alvo útil para dissecar a dinâmica de membranas, a sinalização dependente de tráfego e a regulação de isoformas específica por tipo celular em sistemas modelo humanos.

Amphiphysin II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BIN1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Amphiphysin II O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BIN1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BIN1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Amphiphysin II. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BIN1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Amphiphysin II no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Amphiphysin II em células tumorais com expressão de BIN1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.