Ameloblastin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403086-ACT

AMBN codifica a ameloblastina, uma glicoproteína secretada da matriz extracelular altamente enriquecida durante a formação do esmalte e que contribui para a adesão, a polaridade e a deposição mineral controlada dos ameloblastos. A ameloblastina participa da sinalização matriz–célula e coordena a diferenciação do órgão do esmalte ao modular a organização da matriz extracelular e programas de desenvolvimento epitelial associados. Além de seu papel na morfogênese dentária, a expressão de AMBN tem sido associada à regulação da migração e da diferenciação celular em contextos de tecidos mineralizados, tornando-a relevante para estudos do desenvolvimento craniofacial e da integridade estrutural do esmalte. Assim, a atividade ou expressão desregulada de AMBN é de interesse para investigar os mecanismos moleculares subjacentes a defeitos do esmalte e a interações mais amplas entre epitélio e matriz.

Ameloblastin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMBN sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Ameloblastin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMBN em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMBN, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Ameloblastin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMBN nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Ameloblastin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Ameloblastin em células tumorais com expressão de AMBN silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.