AMBP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403136-ACT

O AMBP humano codifica o precursor de alfa-1-microglobulina/bikunina, uma glicoproteína secretada que é processada proteoliticamente para gerar alfa-1-microglobulina e bikunina. A alfa-1-microglobulina está implicada na ligação ao heme e na defesa extracelular associada ao estado redox, contribuindo para o controle do estresse oxidativo e da lesão tecidual inflamatória, enquanto a bikunina atua como um inibidor de serino proteases do tipo Kunitz que modula a proteólise pericelular. Por meio dessas atividades, o AMBP se integra a vias que regulam a remodelação da matriz extracelular, cascatas de proteases relacionadas à coagulação e a inflamação. A expressão ou o processamento desregulados de AMBP têm sido associados à fisiopatologia renal e hepática, a estados inflamatórios sistêmicos e à remodelação do microambiente tumoral, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de proteostase e de respostas a dano tecidual.

AMBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AMBP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AMBP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AMBP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AMBP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AMBP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AMBP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AMBP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AMBP em células tumorais com expressão de AMBP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.