ALKBH5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-435243-ACT

Mouse Alkbh5 codifica a ALKBH5, uma desmetilase de RNA dependente de Fe(II)/α-cetoglutarato que remove marcas de N6-metiladenosina (m6A) para regular a estabilidade do RNA, o splicing, a exportação nuclear e a tradução. Ao moldar estados epitranscritômicos, a ALKBH5 influencia programas de expressão gênica que controlam a proliferação celular, a diferenciação, as respostas ao estresse e processos do desenvolvimento. A atividade de ALKBH5 interage com as vias de “escritores” e “leitores” de m6A para modular o destino dos transcritos no núcleo e no citoplasma. A dinâmica desregulada de m6A envolvendo ALKBH5 tem sido associada na literatura a alterações em transições de estado celular e a fenótipos ligados a doenças, sustentando seu uso em estudos mecanísticos do metabolismo de RNA.

ALKBH5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Alkbh5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALKBH5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Alkbh5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Alkbh5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALKBH5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Alkbh5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALKBH5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALKBH5 em células tumorais com expressão de Alkbh5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.