ALKBH2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-407363-ACT

ALKBH2 (homólogo 2 de AlkB) é uma dioxigenase dependente de Fe(II)/2-oxoglutarato que repara danos por alquilação no DNA ao reverter diretamente lesões como 1-metiladenina e 3-metilcitosina. Ao restaurar o pareamento normal de bases, a ALKBH2 contribui para a estabilidade do genoma durante a replicação do DNA e atua em coordenação com o reparo por excisão de bases e vias mais amplas de resposta a danos no DNA. Sua atividade é relevante para as respostas celulares a agentes alquilantes endógenos e ambientais, relacionando a expressão de ALKBH2 à carga mutacional e ao estresse replicativo. A regulação alterada de ALKBH2 tem sido estudada em contextos de biologia tumoral e de tolerância a danos no DNA associados a tratamentos, nos quais mudanças na capacidade de reparo podem influenciar fenótipos de integridade genômica.

ALKBH2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ALKBH2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALKBH2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ALKBH2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ALKBH2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALKBH2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ALKBH2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALKBH2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALKBH2 em células tumorais com expressão de ALKBH2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.