Plasmide CRISPR d'Activation (h) ALKBH2: sc-407363-ACT

ALKBH2 (homologue 2 d’AlkB) est une dioxygénase dépendante du Fe(II) et du 2‑oxoglutarate qui répare les dommages d’alkylation dans l’ADN en inversant directement des lésions telles que la 1‑méthyladénine et la 3‑méthylcytosine. En rétablissant un appariement normal des bases, ALKBH2 contribue à la stabilité du génome lors de la réplication de l’ADN et agit de concert avec la réparation par excision de base ainsi qu’avec des voies plus larges de réponse aux dommages de l’ADN. Son activité est pertinente pour les réponses cellulaires aux agents alkylants endogènes et environnementaux, ce qui relie l’expression d’ALKBH2 à la charge mutationnelle et au stress réplicatif. Une régulation altérée d’ALKBH2 a été étudiée dans des contextes de biologie tumorale et de tolérance aux dommages de l’ADN associés aux traitements, où des variations de la capacité de réparation peuvent influencer les phénotypes d’intégrité génomique.

ALKBH2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ALKBH2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ALKBH2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ALKBH2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ALKBH2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ALKBH2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ALKBH2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ALKBH2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ALKBH2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ALKBH2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.