Alix Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400350-ACT

PDCD6IP codifica Alix, um adaptador associado ao ESCRT que coordena a triagem endossomal, a biogênese de corpos multivesiculares, a abscisão na citocinese e o reparo da membrana plasmática por meio de interações com componentes do ESCRT-III e com a sintenina. Alix também participa da formação de exossomos e da downregulation de receptores, influenciando vias de sinalização que dependem do tráfego de membranas e da seleção de cargas dependente de ubiquitina. Por meio de suas funções no remodelamento de membranas e na coordenação do citoesqueleto, Alix impacta processos relacionados à autofagia e o brotamento viral de vírus envelopados que sequestram a maquinaria ESCRT. A desregulação do tráfego ligado a PDCD6IP/Alix e da dinâmica de vesículas extracelulares tem sido associada a fenótipos relevantes para invasão de células cancerígenas, neurodegeneração e sinalização imune alterada, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos de vias.

Alix O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDCD6IP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Alix O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDCD6IP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDCD6IP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Alix. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDCD6IP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Alix no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Alix em células tumorais com expressão de PDCD6IP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.