Aldose Reductase Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401437-ACT

AKR1B1 codifica a aldose redutase humana, uma oxidorredutase dependente de NADPH que catalisa a redução da glicose e de outros aldeídos aos seus álcoois correspondentes. Ela é um ponto de entrada fundamental da via do poliol, influenciando o equilíbrio redox intracelular por meio do consumo de NADPH e contribuindo para respostas a estresse osmótico e oxidativo. A aldose redutase também participa da detoxificação de espécies carbonílicas reativas e de aldeídos derivados da peroxidação lipídica, ligando a atividade de AKR1B1 à sinalização de estresse celular e a processos inflamatórios. A expressão ou atividade desregulada de AKR1B1 tem sido associada a fenótipos de estresse metabólico e a complicações relacionadas ao diabetes, bem como a contextos mais amplos de dano oxidativo e lesão tecidual.

Aldose Reductase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AKR1B1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Aldose Reductase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AKR1B1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AKR1B1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Aldose Reductase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AKR1B1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Aldose Reductase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Aldose Reductase em células tumorais com expressão de AKR1B1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.