Plasmide CRISPR d'Activation (m) Akt2: sc-419072-ACT

Chez la souris, Akt2 code la kinase sérine/thréonine AKT2, un effecteur central de la signalisation PI3K qui relie les signaux provenant de l’insuline et des récepteurs aux facteurs de croissance au métabolisme, à la survie et à la croissance cellulaires. AKT2 régule le trafic de GLUT4 et la captation du glucose, la synthèse du glycogène via l’inhibition de GSK3, ainsi que la synthèse protéique médiée par mTORC1, tout en influençant la transcription dépendante de FOXO et les voies apoptotiques. Dans les tissus métaboliques, l’activité d’Akt2 façonne l’adipogenèse et les programmes hépatiques de gluconéogenèse, et une signalisation altérée est largement utilisée pour modéliser la résistance à l’insuline et des phénotypes pertinents pour le diabète. De plus, une signalisation AKT2 dérégulée recoupe les réseaux oncogéniques PI3K–AKT–mTOR, qui influent sur la prolifération, la migration et l’adaptation au stress dans divers systèmes expérimentaux.

Akt2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Akt2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Akt2 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Akt2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Akt2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Akt2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Akt2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Akt2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Akt2 dans les cellules tumorales présentant une expression de Akt2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.