AIP4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401677-ACT

O ITCH humano codifica a ligase E3 de ubiquitina do tipo HECT AIP4, um regulador-chave do turnover proteico que controla a duração da sinalização ao catalisar a ubiquitinação e o direcionamento proteassomal ou lisossomal de substratos específicos. A AIP4 modula múltiplas vias, incluindo a sinalização do receptor de células T, as vias NF-κB e MAPK e a dinâmica da via TGF-β/SMAD, influenciando assim a homeostase imune, a inflamação e as respostas ao stress celular. Ao regular a estabilidade e o tráfego de receptores e adaptadores de sinalização, o ITCH afeta programas associados à apoptose, à diferenciação e à transição epitélio–mesênquima. A atividade ou expressão desregulada de ITCH tem sido associada a fenótipos de desregulação imune e a redes de sinalização oncogénica alteradas, tornando-o um nó útil para estudos mecanísticos do controlo de vias dependentes de ubiquitina.

AIP4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ITCH sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AIP4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ITCH em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ITCH, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AIP4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ITCH nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AIP4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AIP4 em células tumorais com expressão de ITCH silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.