AHA-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404964-ACT

AHSA1 codifica a AHA-1, uma cochaperona de HSP90 que se liga à HSP90 e acelera o seu ciclo ATPase, promovendo o dobramento, a maturação e a estabilidade eficientes de proteínas cliente. Ao modular a maquinaria de chaperonas da HSP90, a AHA-1 influencia a proteostase, as respostas ao estresse e a atividade funcional de proteínas de sinalização envolvidas no controle do ciclo celular e em vias de sobrevivência. A atividade de chaperona desregulada e a expressão alterada de AHSA1 têm sido associadas a estados de estresse proteotóxico e à remodelação de redes proteicas ligadas à oncogênese e à neurodegeneração. Como resultado, AHSA1 é um alvo útil para estudar a dependência de clientes da HSP90, a adaptação celular ao estresse e o redirecionamento de vias em sistemas modelo relevantes para doenças.

AHA-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AHSA1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AHA-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AHSA1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AHSA1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AHA-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AHSA1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AHA-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AHA-1 em células tumorais com expressão de AHSA1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.