AGR3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-406892-ACT

A proteína gradiente anterior 3 (AGR3) é um membro humano da família das isomerases de dissulfeto de proteínas, localizada na via secretória, onde dá suporte ao dobramento oxidativo de proteínas e à maturação de proteínas cliente específicas. A AGR3 contribui para a proteostase do retículo endoplasmático e para programas de diferenciação epitelial, e sua expressão costuma ser enriquecida em epitélios secretores e produtores de muco. A expressão desregulada de AGR3 foi relatada em diversas neoplasias epiteliais e tem sido estudada no contexto do fenótipo de células tumorais, da adaptação ao estresse e do remodelamento da via secretória. Essas características tornam a AGR3 um alvo útil para investigar o controle de qualidade do RE, a sinalização ligada à secreção e estados transcricionais associados à biologia epitelial.

AGR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de AGR3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

AGR3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus AGR3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição AGR3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de AGR3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus AGR3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de AGR3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via AGR3 em células tumorais com expressão de AGR3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.