Adenylate cyclase 10/ADCY10 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-435448-ACT

Adcy10 codifica a adenilato ciclase 10 (ADCY10), uma adenilil ciclase “solúvel” atípica, regulada por bicarbonato e Ca2+, que gera cAMP de forma independente da sinalização por receptores acoplados à proteína G. Ao controlar a produção local de cAMP, a ADCY10 modula a sinalização dependente de PKA e de EPAC, influenciando redes de fosforilação, o transporte iônico e programas transcricionais, como a regulação gênica mediada pelo elemento de resposta ao cAMP (CRE). Em sistemas murinos, a atividade de Adcy10 é frequentemente estudada no contexto do sensoriamento intracelular de pH/CO2, de microdomínios metabólicos e mitocondriais de cAMP e da comunicação cruzada de sinalização com a dinâmica de cálcio. A desregulação da sinalização por cAMP está amplamente implicada em defeitos na homeostase celular e em fenótipos dependentes de sinalização, sustentando o uso de Adcy10 como um nó mecanístico em modelos de doença focados em vias, sem implicar desfechos clínicos.

Adenylate cyclase 10/ADCY10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Adcy10 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Adenylate cyclase 10/ADCY10 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Adcy10 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Adcy10, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Adenylate cyclase 10/ADCY10. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Adcy10 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Adenylate cyclase 10/ADCY10 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Adenylate cyclase 10/ADCY10 em células tumorais com expressão de Adcy10 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.