ADAMTS-13 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402782-ACT

ADAMTS13 codifica a ADAMTS-13, uma metaloprotease secretada dependente de zinco que cliva especificamente multímeros ultragrandes do fator de von Willebrand (VWF), regulando assim a adesão plaquetária e a formação de trombos sob elevado estresse de cisalhamento. Ao controlar o tamanho e a distribuição dos multímeros de VWF, a ADAMTS-13 modula a proteólise extracelular relacionada à hemostasia e as interações endotélio-plaqueta no microambiente vascular. A redução da atividade de ADAMTS-13 ou o processamento desregulado do VWF está associada a distúrbios trombóticos microangiopáticos, tornando ADAMTS13 um locus-chave para o estudo da biologia da coagulação e da inflamação vascular. A ADAMTS-13 também oferece um ponto de entrada funcional para investigar vias que conectam a ativação endotelial, a mecanobiologia dependente de cisalhamento e redes de proteases plasmáticas.

ADAMTS-13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ADAMTS13 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ADAMTS-13 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ADAMTS13 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ADAMTS13, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ADAMTS-13. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ADAMTS13 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ADAMTS-13 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ADAMTS-13 em células tumorais com expressão de ADAMTS13 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.