ACTA2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-418973-ACT

Acta2 codifica a actina alfa de músculo liso (ACTA2), um componente central do aparato contrátil em células musculares lisas vasculares, miofibroblastos e outras linhagens mesenquimais. A ACTA2 polimeriza-se em filamentos de actina que coordenam a organização do citoesqueleto, a adesão celular e a geração de força durante a migração, a remodelação tecidual e a reparação de feridas. A sua expressão é rigidamente regulada por mecanismos de mecanotransdução e por programas de diferenciação, incluindo a sinalização RhoA/ROCK e o controlo transcricional SRF–MRTF, sendo frequentemente induzida a jusante da ativação de miofibroblastos mediada por TGF-β. A atividade e a expressão desreguladas de ACTA2 são amplamente utilizadas como leituras em estudos de remodelação vascular, mudança fenotípica associada à fibrose e disfunção do músculo liso em modelos de doenças cardiopulmonares e do tecido conjuntivo.

ACTA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Acta2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ACTA2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Acta2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Acta2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ACTA2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Acta2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ACTA2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ACTA2 em células tumorais com expressão de Acta2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.