Acid Ceramidase Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-419216-ACT

O gene Asah1 de camundongo codifica a ceramidase ácida, uma hidrolase lisossomal que desacetila a ceramida para gerar esfingosina e ácidos graxos livres, moldando o equilíbrio entre o armazenamento e a renovação de esfingolipídios. Ao regular os pools de ceramida e esfingosina, a Ceramidase Ácida influencia o tráfego de membranas dependente de lisossomos, a autofagia e redes de sinalização responsivas ao estresse ligadas à sobrevivência celular e a respostas inflamatórias. A disfunção da atividade de ASAH1 está associada ao acúmulo de esfingolipídios e à disfunção lisossomal, conectando essa via a fenótipos neurodegenerativos e metabólicos sistêmicos. Assim, Asah1 é um nó-chave para estudar a sinalização lipídica centrada em ceramida e a homeostase lisossomal em modelos celulares e in vivo de camundongo.

Acid Ceramidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Asah1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Acid Ceramidase O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Asah1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Asah1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Acid Ceramidase. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Asah1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Acid Ceramidase no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Acid Ceramidase em células tumorais com expressão de Asah1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.