ABCG8 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402453-ACT

ABCG8 codifica um meio-transportador da família ATP-binding cassette (ABC) que forma um heterodímero com o ABCG5 para constituir uma bomba funcional de efluxo de esteróis na membrana apical dos enterócitos e na membrana canalicular dos hepatócitos. Esse complexo limita a absorção intestinal e promove a excreção biliar de esteróis da dieta, modulando a homeostase sistêmica de colesterol e fitoesteróis por meio de vias coordenadas de transporte e processamento de lipídios. A interrupção da atividade de ABCG8 perturba o tráfego de esteróis e está associada a perfis plasmáticos de esteróis desregulados e a fenótipos hereditários de acúmulo de esteróis, incluindo apresentações semelhantes à sitosterolemia. Como resultado, ABCG8 é amplamente estudado na regulação metabólica, na biologia do transporte de lipídios e nas relações genótipo–fenótipo no metabolismo de esteróis.

ABCG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ABCG8 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ABCG8 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ABCG8 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ABCG8, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ABCG8. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ABCG8 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ABCG8 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ABCG8 em células tumorais com expressão de ABCG8 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.