4E-BP1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400398-ACT

EIF4EBP1 codifica a 4E-BP1, um repressor da tradução dependente de cap sensível à fosforilação, que se liga à EIF4E e limita a montagem do complexo eIF4F. Como um importante efetor a jusante da sinalização PI3K–AKT–mTOR, a 4E-BP1 integra sinais de fatores de crescimento, nutrientes e estresse para ajustar a síntese proteica global, o crescimento celular e a adaptação metabólica. A fosforilação de 4E-BP1 mediada por mTORC1 libera a EIF4E para promover a tradução de transcritos envolvidos em proliferação e sobrevivência, vinculando a regulação de EIF4EBP1 à proteostase e ao controle do ciclo celular. A atividade desregulada de 4E-BP1 e seu estado de fosforilação são frequentemente estudados em biologia do câncer, sinalização metabólica e respostas ao estresse, em contextos nos quais a reprogramação translacional contribui para fenótipos associados a doenças.

4E-BP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EIF4EBP1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

4E-BP1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EIF4EBP1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EIF4EBP1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 4E-BP1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EIF4EBP1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 4E-BP1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 4E-BP1 em células tumorais com expressão de EIF4EBP1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.