14-3-3 θ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401384-ACT

YWHAQ codifica a proteína adaptadora humana 14-3-3 teta, membro da família 14-3-3 que se liga a motivos de fosfoserina/fosfotreonina para modular a localização, a estabilidade e a atividade de diversas proteínas de sinalização. Por meio dessas interações, a 14-3-3 teta ajuda a coordenar o controle do ciclo celular, as respostas ao estresse e a sinalização apoptótica, interligando-se a redes dependentes de quinases como as vias MAPK/ERK, PI3K-AKT e relacionadas à RAF. Sua função de “scaffold” influencia o tráfego de proteínas e a dinâmica do citoesqueleto, contribuindo para a regulação de programas transcricionais e para a homeostase metabólica. Interações 14-3-3 desreguladas e alterações na expressão de YWHAQ têm sido associadas a fenótipos relevantes para a biologia do câncer e a neurobiologia, apoiando seu uso em estudos mecanísticos de reprogramação de sinalização e adaptação celular ao estresse.

14-3-3 θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de YWHAQ sem alterar a sequência de ADN subjacente.

14-3-3 θ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus YWHAQ em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição YWHAQ, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de 14-3-3 θ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus YWHAQ nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de 14-3-3 θ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via 14-3-3 θ em células tumorais com expressão de YWHAQ silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.