γ-GCSm Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-420574-ACT

Gclm codifica a subunidade modificadora da ligase glutamato-cisteína (γ-GCSm), um componente-chave da etapa limitante da velocidade na biossíntese de glutationa (GSH). Ao regular a eficiência catalítica e a afinidade por substrato do complexo ligase γ-glutamilcisteína, a γ-GCSm ajuda a manter o equilíbrio redox intracelular e dá suporte à desintoxicação de eletrófilos e de espécies reativas de oxigênio. A atividade de Gclm está ligada a redes de resposta ao estresse oxidativo, incluindo programas antioxidantes dependentes de NRF2, a homeostase redox mitocondrial e o metabolismo de xenobióticos. Alterações na capacidade de Gclm/GSH são amplamente usadas para modelar suscetibilidade a lesão oxidativa e fenótipos associados ao redox, relevantes para neurodegeneração, disfunção metabólica, inflamação e respostas a tóxicos em sistemas murinos.

γ-GCSm O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Gclm sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γ-GCSm O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Gclm em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Gclm, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γ-GCSm. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Gclm nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γ-GCSm no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γ-GCSm em células tumorais com expressão de Gclm silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.