γC-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402940-ACT

CRYGC codifica a γC-cristalina humana, uma proteína estrutural altamente abundante do cristalino ocular que contribui para o índice de refração e para a transparência a longo prazo por meio de complexos proteicos estáveis e densamente empacotados. Como membro da superfamília das β/γ-cristalinas, a γC-cristalina sustenta a arquitetura das células das fibras do cristalino e a proteostase em condições de mínima renovação proteica. A perturbação da homeostase das cristalinas pode favorecer o mau enovelamento e a agregação de proteínas, associando a desregulação de CRYGC a fenótipos de opacidade do cristalino. Assim, CRYGC é amplamente utilizado como marcador e ponto de entrada mecanístico para estudar o desenvolvimento do cristalino, respostas ao estresse e processos de agregação proteica relevantes para a biologia da catarata.

γC-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYGC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γC-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYGC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYGC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γC-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYGC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γC-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γC-crystallin em células tumorais com expressão de CRYGC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.