γB-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402939-ACT

CRYGB codifica a γB-cristalina humana, uma proteína estrutural do cristalino altamente abundante e de longa duração, que contribui para o índice de refração e a transparência óptica por meio de um empacotamento proteico denso, porém solúvel. Como membro da superfamília das β/γ-cristalinas, a γB-cristalina sustenta a homeostase das células das fibras do cristalino ao manter a estabilidade proteica e resistir à agregação sob condições de estresse oxidativo e osmótico. A desregulação da proteostase das cristalinas está ligada à formação de agregados que dispersam a luz e à opacificação do cristalino, e variantes de CRYGB têm sido associadas a fenótipos de catarata hereditária. Consequentemente, CRYGB é amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento do cristalino, o dobramento/agregação de proteínas e vias responsivas ao estresse que influenciam a transparência.

γB-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYGB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

γB-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYGB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYGB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de γB-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYGB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de γB-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via γB-crystallin em células tumorais com expressão de CRYGB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.