βB2-crystallin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403626-ACT

CRYBB2 codifica a βB2-cristalina, um importante componente estrutural do cristalino dos vertebrados que contribui para a montagem do complexo de cristalinas, a manutenção do índice de refração e a transparência do cristalino a longo prazo. Por ser uma proteína altamente expressa e excepcionalmente estável, a βB2-cristalina sustenta a proteostase das células das fibras do cristalino e ajuda a limitar a agregação proteica durante a maturação e o envelhecimento. A alteração da expressão de CRYBB2 ou o mau dobramento de cristalinas está associada a perturbações na arquitetura do cristalino e é frequentemente estudada no contexto da cataratogênese e de outros fenótipos de opacificação do cristalino. Como as células das fibras do cristalino têm poucos organelos e dependem de redes proteicas duráveis, CRYBB2 serve como modelo para investigar interações com chaperonas, respostas ao stresse redox e a estabilidade de proteínas em condições de elevada densidade molecular.

βB2-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CRYBB2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

βB2-crystallin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CRYBB2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CRYBB2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de βB2-crystallin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CRYBB2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de βB2-crystallin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via βB2-crystallin em células tumorais com expressão de CRYBB2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.