α-actinin-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-430958-ACT

Actn1 codifica a α-actinina-1, uma proteína de ligação à actina insensível a Ca2+ que faz a ligação cruzada da F-actina e ancora redes do citoesqueleto a complexos de adesão. Em células de camundongo, a α-actinina-1 sustenta a organização de fibras de estresse, a maturação de adesões focais e a mecanotransdução, influenciando a forma celular, a migração e a citocinese. Por meio de interações com integrinas, vinculina e efetores de sinalização a jusante de GTPases da família Rho, ela contribui para a remodelação dinâmica do citoesqueleto de actina e para a rigidez celular. A função desregulada de ACTN1 tem sido associada a defeitos do citoesqueleto de plaquetas e a alterações na arquitetura tecidual, tornando-a relevante para o estudo de fenótipos associados ao citoesqueleto e de seus determinantes moleculares.

α-actinin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Actn1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

α-actinin-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Actn1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Actn1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de α-actinin-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Actn1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de α-actinin-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via α-actinin-1 em células tumorais com expressão de Actn1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.