ZBTB43 Plasmide KO CRISPR/Cas9 (h): sc-407486

Panoramica

ZBTB43 (zinc finger e dominio BTB contenente 43) codifica un presunto regolatore trascrizionale appartenente alla famiglia di proteine BTB/POZ-zinc finger, una classe di fattori che spesso combina il legame al DNA in modo sequenza-specifico con il reclutamento di complessi che modificano la cromatina. Attraverso interazioni proteiche mediate dal dominio BTB e un targeting dipendente dalle dita di zinco C2H2, si prevede che ZBTB43 influenzi programmi trascrizionali legati al mantenimento dello stato cellulare, alla specificazione del destino di linea e al controllo epigenetico. La deregolazione dei fattori di trascrizione BTB-zinc finger è frequentemente associata ad alterazioni della differenziazione e a cambiamenti dell’espressione genica su scala genomica osservati in diversi contesti patologici, inclusi il cancro e i disturbi dello sviluppo. Di conseguenza, ZBTB43 rappresenta un bersaglio rilevante per analizzare i meccanismi di repressione/attivazione trascrizionale e le vie associate alla cromatina nelle cellule umane.

ZBTB43 Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (h) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene ZBTB43 in human linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus ZBTB43, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il ZBTB43 Plasmide HDR (h) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito ZBTB43.
Se cotrasfettato con il ZBTB43 Plasmide CRISPR/Cas9 KO (h):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto ZBTB43.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus ZBTB43 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni ZBTB43 critici per la funzione ZBTB43
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.