XPF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401692-ACT

ERCC4 codifica l’endonucleasi umana specifica per strutture XPF, che forma un eterodimero con ERCC1 per effettuare l’incisione 5′ durante la riparazione per escissione di nucleotidi (NER) e per processare i crosslink interfilamento del DNA tramite la rete dell’anemia di Fanconi/HR. XPF riconosce strutture di DNA ramificate e contribuisce alla risoluzione delle forcelle di replicazione bloccate, mantenendo la stabilità del genoma sotto stress endogeno e genotossico. L’alterazione della funzione di ERCC4/XPF è associata a sindromi da deficit di riparazione del DNA, tra cui lo xeroderma pigmentoso e fenotipi progeroidi correlati, ed è rilevante negli studi di carcinogenesi per via della ridotta rimozione delle lesioni e dell’aumento del carico mutazionale. Di conseguenza, ERCC4 viene spesso analizzato in modelli di risposta al danno da UV, riparazione dei crosslink, stress replicativo e segnalazione dei checkpoint.

XPF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERCC4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

XPF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERCC4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERCC4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di XPF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERCC4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da XPF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via XPF nelle cellule tumorali con espressione di ERCC4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.