Wig-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-406638-ACT

ZMAT3 (Wig-1) è una proteina legante l’RNA con dita di zinco inducibile da p53, che regola l’espressione genica post-trascrizionale legandosi a elementi ricchi in AU e stabilizzando o modulando la traduzione di specifici mRNA. Attraverso il controllo del turnover dell’RNA e dei trascritti responsivi allo stress, Wig-1 influenza la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi e i programmi di sorveglianza dell’RNA che modellano le risposte cellulari al danno al DNA e allo stress oncogenico. Un’attività deregolata di ZMAT3 è stata collegata a un’alterata resa funzionale della rete di p53 e a cambiamenti nelle firme di espressione genica associate ai tumori, rendendola rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro e nella segnalazione dello stress. Le sue funzioni di legame all’RNA supportano inoltre l’indagine delle vie di stabilità dell’mRNA e della regolazione dipendente dal contesto di trascritti pro- e anti-apoptotici.

Wig-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ZMAT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Wig-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ZMAT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ZMAT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Wig-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ZMAT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Wig-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Wig-1 nelle cellule tumorali con espressione di ZMAT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.