VMAT 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401308-ACT

SLC18A2 codifica il trasportatore vescicolare delle monoamine 2 (VMAT2), un antiporto protonico che impacchetta la dopamina, la serotonina, la noradrenalina, l’adrenalina e l’istamina citosoliche in vescicole secretorie, accoppiando il trasporto al gradiente elettrochimico di H+ vescicolare. Questa fase di caricamento vescicolare è fondamentale per l’immagazzinamento e il rilascio regolati dei neurotrasmettitori, influenza l’intensità della segnalazione sinaptica e limita l’accumulo citosolico di monoamine, che può favorire lo stress ossidativo. La funzione di VMAT2 si integra con le vie di biogenesi e traffico delle vescicole ed è strettamente legata all’omeostasi presinaptica nei neuroni monoaminergici e nelle cellule neuroendocrine. Un’alterazione dell’espressione di SLC18A2 o dell’attività di VMAT2 è stata associata alla vulnerabilità del sistema dopaminergico ed è stata studiata nel contesto della malattia di Parkinson, dei disturbi dell’umore e delle neuroadattamenti legati all’uso di sostanze.

VMAT 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC18A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VMAT 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC18A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC18A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VMAT 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC18A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VMAT 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VMAT 2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC18A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.