VGF CRISPR Activation Plasmid (m): sc-436316-ACT

Vgf kodiert VGF, ein neuroendokrines Sekretgranula-Protein, das proteolytisch zu bioaktiven Peptiden verarbeitet wird, die die neuronale Erregbarkeit, synaptische Plastizität und die neuroendokrine Kommunikation beeinflussen. In Mausgeweben wird die VGF-Expression durch trophische Signale und aktivitätsabhängige Transkriptionsprogramme induziert und ist damit mit Signalwegen verknüpft, die Energiebilanz, Stressreaktionen und Neurogenese regulieren. Von VGF abgeleitete Peptide modulieren die Neurotransmitterfreisetzung und die metabolische Homöostase durch Wechselwirkungen mit Neuropeptid-Signalnetzwerken sowie nachgeschalteten cAMP/PKA- und MAPK-assoziierten Prozessen. Eine dysregulierte Vgf-Expression wurde in experimentellen Modellen mit veränderten stimmungs- und kognitionsbezogenen Phänotypen, metabolischen Störungen sowie allgemein mit Zuständen in Verbindung gebracht, die für neurodegenerative und neuropsychiatrische Erkrankungen relevant sind.

VGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Vgf-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Vgf-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Vgf-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VGF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Vgf-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VGF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VGF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Vgf-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.