VGF Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-436316-ACT

Vgf codifica VGF, una proteina dei granuli secretori neuroendocrini che viene processata proteoliticamente in peptidi bioattivi in grado di influenzare l’eccitabilità neuronale, la plasticità sinaptica e la comunicazione neuroendocrina. Nei tessuti murini, l’espressione di VGF è indotta da segnali trofici e da programmi trascrizionali dipendenti dall’attività, collegandola a vie che regolano l’equilibrio energetico, le risposte allo stress e la neurogenesi. I peptidi derivati da VGF modulano il rilascio di neurotrasmettitori e l’omeostasi metabolica attraverso interazioni con reti di segnalazione dei neuropeptidi e processi a valle associati a cAMP/PKA e MAPK. Una disregolazione dell’espressione di Vgf è stata associata, in modelli sperimentali, ad alterazioni di fenotipi legati all’umore e alla cognizione, a disfunzioni metaboliche e, più in generale, a stati rilevanti per malattie neurodegenerative e neuropsichiatriche.

VGF Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Vgf senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

VGF Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Vgf nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Vgf, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di VGF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Vgf nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da VGF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via VGF nelle cellule tumorali con espressione di Vgf silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.