VAChT CRISPR Activationプラスミド (h): sc-401240-ACT

SLC18A3は、小胞性アセチルコリントランスポーター（VAChT）をコードしており、VAChTはシナプス小胞膜に存在するタンパク質で、コリン作動性ニューロンおよびその他のコリン作動性細胞において、細胞質のアセチルコリンを分泌小胞内へ取り込んで包装します。調節性エキソサイトーシスに用いられる小胞内アセチルコリンを供給することで、VAChTは神経筋接合部ならびに自律神経系・中枢神経系全体におけるシナプス伝達に必須であり、興奮―収縮連関や神経回路の活動に影響を及ぼします。VAChTの機能はアセチルコリン代謝および小胞サイクルの経路と密接に結び付いており、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）依存的な合成や小胞輸送機構との協調を含みます。コリン作動性シグナル伝達の変調やアセチルコリン放出の制御破綻は、複数の神経生物学的文脈で関与が示唆されているため、SLC18A3は疾患関連モデルにおけるコリン作動性機能障害の基盤機構を研究するうえで有用な標的となります。

VAChT CRISPR活性化プラスミド（h）は、基盤となるDNA配列を変更することなく、内因性SLC18A3の発現を標的化し、非破壊的にアップレギュレートするアプローチを提供します。

VAChT CRISPR 活性化プラスミド (h) は、ヒト細胞株における SLC18A3 遺伝子座の高効率かつ部位特異的な転写アップレギュレーションのために設計された、3 つのプラスミドからなる相乗的活性化メディエーター (SAM) システムです。このシステムは、DNA結合能を維持しつつヌクレアーゼ活性を失わせる2つの不活性化変異（D10AおよびN863A）を有する、触媒活性のないCas9（dCas9）を中核としています。このdCas9は、強力な転写活性化因子であるVP64と融合しており、選別用のブラスティシジン耐性遺伝子と共に共発現します。2番目のプラスミドは、dCas9-VP64と協調して機能する二次活性化複合体であるMS2-p65-HSF1融合タンパク質をコードしており、ヒグロマイシン耐性遺伝子と共に発現する。3番目のプラスミドは、標的特異的な20塩基対のsgRNAをコードしており、これはMS2-p65-HSF1複合体を活性化部位に誘導する2つのMS2 RNAアプタマーと融合しており、さらにピューロマイシン耐性遺伝子が付随している。これら3つのプラスミドは、システム構成要素すべてが均等に発現するよう、質量比1:1:1で導入される。

標的遺伝子座に集合すると、SAM複合体はSLC18A3転写開始点の上流約200 bpの領域に結合し、そこでVP64、p65、およびHSF1が協調して転写装置を動員し、内因性VAChTの発現上昇を促進する。ヌクレアーゼ活性を持つCas9とは異なり、 dCas9は二本鎖切断を導入したりゲノム配列を改変したりしないため、天然のSLC18A3遺伝子座が保持され、内因性遺伝子座におけるVAChT依存性の転写応答の研究が可能となります。これにより、機能解析、標的遺伝子の同定、およびSLC18A3発現が沈黙または低下した腫瘍細胞におけるVAChT経路の回復のモデル化を行う上で、貴重なツールとなります。

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。