Plasmide CRISPR d'Activation (h) VAChT: sc-401240-ACT

SLC18A3 code le transporteur vésiculaire de l’acétylcholine (VAChT), une protéine membranaire des vésicules synaptiques qui empaquette l’acétylcholine cytosolique dans des vésicules de sécrétion dans les neurones cholinergiques et d’autres types cellulaires cholinergiques. En fournissant de l’acétylcholine vésiculaire pour l’exocytose régulée, VAChT est indispensable à la transmission synaptique au niveau des jonctions neuromusculaires ainsi que dans l’ensemble des systèmes nerveux autonome et central, en influençant le couplage excitation–contraction et l’activité des circuits neuronaux. La fonction de VAChT est étroitement liée au métabolisme de l’acétylcholine et aux voies du cycle vésiculaire, notamment via sa coordination avec la synthèse dépendante de la choline acétyltransférase et avec la machinerie de trafic vésiculaire. Des altérations de la signalisation cholinergique et une libération dérégulée de l’acétylcholine sont impliquées dans de multiples contextes en neurobiologie, faisant de SLC18A3 une cible utile pour étudier les mécanismes à l’origine des dysfonctionnements cholinergiques dans des modèles pertinents pour les maladies.

VAChT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC18A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VAChT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC18A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC18A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VAChT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC18A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VAChT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VAChT dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC18A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.