Plásmido CRISPR de Activación (h) USP14: sc-403167-ACT

USP14 codifica una enzima desubiquitinante asociada a la partícula reguladora 19S del proteasoma 26S, donde recorta las cadenas de ubiquitina y modula el procesamiento de los sustratos antes de su degradación. Al controlar el reciclaje de ubiquitina y el rendimiento del proteasoma, USP14 influye en la proteostasis celular, las respuestas al estrés y el equilibrio entre el control de calidad proteica y el recambio. Esta actividad se integra con vías que regulan la progresión del ciclo celular, las respuestas al daño del ADN y redes de señalización sensibles a la regulación dependiente de ubiquitina. La función alterada de USP14 se ha estudiado en contextos de desequilibrio de la proteostasis y desregulación de la señalización ubiquitina–proteasoma, relevantes para la neurobiología y fenotipos asociados al cáncer.

USP14 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de USP14 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

USP14 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus USP14 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional USP14, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de USP14. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo USP14 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de USP14 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía USP14 en células tumorales con expresión de USP14 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.