Tyrosinase Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423566-ACT

Il gene Tyr del topo codifica la tirosinasi, un’ossidoreduttasi rame-dipendente che catalizza passaggi chiave e limitanti la velocità nella biosintesi di eumelanina e feomelanina, inclusa la conversione della L-tirosina in DOPA e in DOPAchinone. L’attività della tirosinasi è alla base dei programmi di differenziamento dei melanociti e collega la melanogenesi all’equilibrio redox, alla biogenesi dei melanosomi e alla maturazione dei granuli pigmentari. Alterazioni dell’espressione di Tyr o della funzione enzimatica sono strettamente associate ai fenotipi di pigmentazione e vengono spesso utilizzate come readout molecolare negli studi sulla biologia dei melanociti e sulla regolazione della via della melanina. In quanto enzima ristretto a una specifica linea cellulare e con output biochimici misurabili, la tirosinasi rappresenta un nodo facilmente interrogabile per studiare le reti di segnalazione associate al pigmento e le risposte allo stress.

Tyrosinase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tyr senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tyrosinase Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tyr nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tyr, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tyrosinase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tyr nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tyrosinase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tyrosinase nelle cellule tumorali con espressione di Tyr silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.