TSHR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400848-ACT

Il recettore dell’ormone tireostimolante (TSHR) è un GPCR di classe A glicosilato, espresso principalmente nelle cellule follicolari della tiroide, dove trasduce i segnali del TSH ipofisario per regolare la biosintesi degli ormoni tiroidei e la crescita della ghiandola. In seguito al legame con il ligando, il TSHR attiva la segnalazione cAMP/PKA mediata da Gαs e può anche attivare le vie Gαq/PLC e MAPK, coordinando programmi trascrizionali che controllano l’assorbimento dello ioduro, la processazione della tireoglobulina e la differenziazione специфica tiroidea. Una segnalazione o un’espressione del TSHR deregolate sono associate alle malattie autoimmuni della tiroide, inclusa la malattia di Graves, e ad alterazioni dell’omeostasi tiroidea che possono contribuire a noduli iperfunzionanti e alla trasformazione neoplastica. In quanto recettore di superficie che integra segnali endocrini e correlati all’immunità, il TSHR è un modello chiave per lo studio del traffico dei GPCR, della desensibilizzazione recettoriale e delle reti regolatorie della linea tiroidea.

TSHR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TSHR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TSHR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TSHR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TSHR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TSHR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TSHR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TSHR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TSHR nelle cellule tumorali con espressione di TSHR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.