Trp7 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408046-ACT

TRPM2 (auch bekannt als Trp7) kodiert einen Ca2+-permeablen, nichtselektiven Kationenkanal der TRP-Familie, der durch ADP-Ribose aktiviert und durch intrazellulären oxidativen Stress reguliert wird. Der durch TRPM2 vermittelte Ca2+-Einstrom koppelt Redoxsignale an nachgeschaltete Prozesse, darunter die mitochondriale Funktion, die Produktion von Zytokinen und Chemokinen, inflammasomassoziierte Antworten sowie Zelltodprogramme wie Apoptose und Nekroptose. Der Kanal integriert Signale aus dem NAD+-Stoffwechsel und der PARP-abhängigen Signalübertragung, um die Calciumhomöostase und stressadaptive transkriptionelle Antworten zu steuern. Eine fehlregulierte TRPM2-Aktivität wurde mit entzündlichen und neurodegenerativen Mechanismen, der Biologie von Ischämie-Reperfusions-Schädigungen sowie tumorassoziierter Signalgebung im Mikromilieu in Verbindung gebracht, was seine Relevanz für Modelle zur Analyse von Signalwegen unterstreicht.

Trp7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRPM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Trp7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRPM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRPM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Trp7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRPM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Trp7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Trp7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRPM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.