TREK-1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-421244-ACT

O gene Kcnk2 de camundongo codifica o TREK-1, um canal de potássio (K2P) de dois poros sensível a estímulos mecânicos, que fornece uma condutância basal de K+ para estabilizar o potencial de membrana em repouso e ajustar a excitabilidade neuronal e glial. O TREK-1 integra sinais de estiramento da membrana, temperatura, pH intracelular e mediadores lipídicos para acoplar pistas biofísicas a mudanças na polarização da membrana, moldando o disparo de potenciais de ação e a transmissão sináptica. Por seu papel na manutenção da homeostase iônica, o TREK-1 influencia processos como neuroproteção, processamento de sinais de dor e atividade de circuitos responsivos ao estresse. Alterações na função de Kcnk2/TREK-1 têm sido estudadas no contexto de fenótipos neurológicos e neuropsiquiátricos, tornando-o relevante para a investigação de vias mecanísticas em sistemas de modelos murinos.

TREK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Kcnk2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TREK-1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Kcnk2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Kcnk2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TREK-1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Kcnk2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TREK-1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TREK-1 em células tumorais com expressão de Kcnk2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.