TFIIH p89 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401124-ACT

ERCC3 codifica l’elicasi umana TFIIH p89 (XPB), un fattore di svolgimento del DNA dipendente dall’ATP essenziale sia per l’inizio della trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II sia per la riparazione per escissione di nucleotidi (NER). All’interno del complesso TFIIH, TFIIH p89 coordina l’apertura del promotore durante la trascrizione e partecipa alla verifica del danno e allo svolgimento della lesione durante la rimozione di addotti ingombranti del DNA, collegando la regolazione trascrizionale al mantenimento del genoma. L’alterazione dei processi di riparazione mediati da ERCC3 e di quelli accoppiati alla trascrizione è associata a ipersensibilità allo stress genotossico e a patologie sindromiche, tra cui lo xeroderma pigmentoso e la tricotiodistrofia, rendendo ERCC3 un nodo chiave negli studi sulle risposte al danno del DNA e sull’integrità della trascrizione.

TFIIH p89 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ERCC3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TFIIH p89 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ERCC3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ERCC3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TFIIH p89. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ERCC3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TFIIH p89 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TFIIH p89 nelle cellule tumorali con espressione di ERCC3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.