TCP-1 γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403203-ACT

CCT3 codifica la subunità gamma umana della TCP-1 del complesso chaperoninico citosolico contenente TCP1 (CCT/TRiC), una macchina di ripiegamento essenziale e dipendente dall’ATP per molte proteine di nuova sintesi. CCT/TRiC sostiene la proteostasi promuovendo il corretto ripiegamento di proteine del citoscheletro come actina e tubulina e influenza la maturazione di diversi regolatori della segnalazione che modellano la crescita cellulare e le risposte allo stress. Attraverso queste funzioni, la TCP-1 gamma contribuisce a vie che governano l’organizzazione del citoscheletro, la progressione del ciclo cellulare e il controllo della qualità proteica. Un’attività chaperoninica deregolata è stata associata ad alterazioni della stabilità del proteoma in contesti proliferativi e neurodegenerativi, rendendo CCT3 un nodo utile per studi meccanicistici di fenotipi dipendenti dal ripiegamento.

TCP-1 γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CCT3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

TCP-1 γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CCT3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CCT3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di TCP-1 γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CCT3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da TCP-1 γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via TCP-1 γ nelle cellule tumorali con espressione di CCT3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.