TCP-1 γ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403203-ACT

CCT3 codifica a subunidade gama humana TCP-1 do complexo citosólico de chaperonina contendo TCP1 (CCT/TRiC), uma máquina essencial de dobramento dependente de ATP para muitas proteínas recém-sintetizadas. O CCT/TRiC sustenta a proteostase ao promover o dobramento correto de proteínas do citoesqueleto, como actina e tubulina, e influencia a maturação de diversos reguladores de sinalização que moldam o crescimento celular e as respostas ao estresse. Por meio dessas funções, a TCP-1 gama contribui para vias que regulam a organização do citoesqueleto, a progressão do ciclo celular e o controle de qualidade de proteínas. A atividade de chaperonina desregulada tem sido associada a alterações na estabilidade do proteoma em contextos proliferativos e neurodegenerativos, tornando o CCT3 um ponto útil para estudos mecanísticos de fenótipos dependentes de dobramento.

TCP-1 γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCT3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TCP-1 γ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCT3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCT3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TCP-1 γ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCT3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TCP-1 γ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TCP-1 γ em células tumorais com expressão de CCT3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.