ST Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400733-ACT

SLC6A4 codifica o transportador de serotonina dependente de sódio e cloreto (ST, também conhecido como SERT), um simportador da membrana plasmática que encerra a sinalização serotoninérgica por meio da recaptação de 5-hidroxitriptamina a partir do espaço extracelular. Ao regular a disponibilidade de serotonina, o ST molda a neurotransmissão, a plasticidade sináptica e redes de sinalização a jusante ligadas a respostas transcricionais dependentes de cAMP/PKA e de MAPK. Além das células neuronais, a atividade de SLC6A4 influencia processos serotoninérgicos periféricos em plaquetas e em tecidos gastrointestinais, que se cruzam com vias neuroimunes e de resposta ao estresse. Alterações na expressão ou na função de SLC6A4 estão associadas à suscetibilidade a fenótipos neuropsiquiátricos e comportamentais, tornando-o um alvo relevante para estudos mecanísticos da regulação de circuitos serotoninérgicos.

ST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SLC6A4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ST O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SLC6A4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SLC6A4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ST. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SLC6A4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ST no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ST em células tumorais com expressão de SLC6A4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.