Sprouty 4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402081-ACT

O SPRY4 codifica a Sprouty 4, um inibidor intracelular de feedback da sinalização por receptores tirosina-quinase que atenua a atividade a jusante da via RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. Ao modular a intensidade e a duração do sinal após estímulo por fatores como FGF, EGF e VEGF, a Sprouty 4 influencia a proliferação, a diferenciação, a migração e a morfogênese de ramificação em múltiplos tipos celulares. Alterações na expressão do SPRY4 ou no seu controle regulatório têm sido associadas a redes de sinalização de fatores de crescimento desreguladas observadas na biologia do câncer e em distúrbios do desenvolvimento, tornando-o um ponto útil para estudos mecanísticos de vias. Seu papel como um “freio” dependente do contexto sobre a sinalização MAPK também sustenta investigações sobre adaptação de sinal, arquitetura de feedback negativo e plasticidade fenotípica.

Sprouty 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPRY4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Sprouty 4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPRY4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPRY4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Sprouty 4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPRY4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Sprouty 4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Sprouty 4 em células tumorais com expressão de SPRY4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.