SMC3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403950-ACT

SMC3 codifica uma proteína central de manutenção estrutural dos cromossomos que forma o complexo coesina com SMC1A e subunidades associadas, para estabelecer a coesão entre cromátides-irmãs durante a fase S e garantir a segregação cromossômica precisa. Além da mitose, a dinâmica da coesina dependente de SMC3 regula o reparo de quebras de dupla fita no DNA, a estabilidade da forquilha de replicação e a organização genômica de ordem superior, que influencia a comunicação entre potenciadores e promotores e os programas de transcrição. Essas funções colocam o SMC3 no centro de vias que controlam a estabilidade do genoma e a progressão do ciclo celular, e sua desregulação está associada a fenótipos de instabilidade cromossômica e a distúrbios do desenvolvimento relacionados à coesina. Na biologia do câncer, alterações na atividade da coesina envolvendo SMC3 são frequentemente estudadas por seus efeitos sobre aneuploidia, capacidade de reparo do DNA e reprogramação transcricional.

SMC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SMC3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SMC3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SMC3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SMC3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SMC3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SMC3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SMC3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SMC3 em células tumorais com expressão de SMC3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.