Shh Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-422926-ACT

Sonic hedgehog (Shh) é um morfogénio secretado que coordena a padronização embrionária e a homeostase dos tecidos no período pós-natal, ao regular a especificação do destino celular, a proliferação e a diferenciação. No rato, a sinalização de SHH é transmitida através de PTCH1/SMO para modular os fatores de transcrição GLI, integrando-se com o tráfego ciliar, a formação de gradientes e redes regulatórias génicas do desenvolvimento. A perturbação da atividade da via SHH influencia processos do neurodesenvolvimento, a morfogénese dos membros e craniofacial, e as interações epitélio–mesênquima. A sinalização SHH desregulada é amplamente utilizada como modelo mecanístico para estudar malformações congénitas e programas oncogénicos conduzidos por hedgehog em diversos contextos tecidulares.

Shh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Shh sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Shh O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Shh em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Shh, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Shh. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Shh nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Shh no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Shh em células tumorais com expressão de Shh silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.