secretin receptor Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403329-ACT

SCTR codifica il recettore umano della secretina, un recettore accoppiato a proteine G di classe B che lega l’ormone peptidico gastrointestinale secretina per regolare la secrezione epiteliale di liquidi e bicarbonato, la funzione dei dotti pancreatici e la fisiologia biliare. In seguito al legame del ligando, SCTR si accoppia principalmente a Gs per stimolare l’adenilato ciclasi, aumentare il cAMP e attivare programmi trascrizionali e di trasporto ionico dipendenti dalla PKA, con ulteriore segnalazione dipendente dal contesto attraverso le vie del calcio e delle MAPK. L’attività del recettore contribuisce a un’omeostasi digestiva e metabolica coordinata ed è spesso studiata negli epiteli secretori e in contesti neuroendocrini. Alterazioni della segnalazione GPCR/cAMP che coinvolgono SCTR sono state investigate in modelli di disfunzione pancreatica e biliare, disturbi gastrointestinali e biologia tumorale ormone-responsiva, come meccanismo che influenza secrezione cellulare, proliferazione e differenziamento.

secretin receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCTR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

secretin receptor Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCTR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCTR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di secretin receptor. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCTR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da secretin receptor nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via secretin receptor nelle cellule tumorali con espressione di SCTR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.