SCD Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401516-ACT

L’SCD umano codifica la stearoil‑CoA desaturasi, un’ossidoreduttasi del reticolo endoplasmatico che catalizza la desaturazione Δ9 di acil‑CoA di acidi grassi saturi in acidi grassi monoinsaturi quali oleato e palmitoleato. Modellando la composizione lipidica delle membrane e generando substrati per la sintesi di trigliceridi, fosfolipidi ed esteri del colesterolo, SCD influenza la biogenesi delle goccioline lipidiche, l’omeostasi del RE e vie di segnalazione metabolica, inclusi programmi regolati da SREBP e PPAR. Un’attività alterata di SCD è stata associata a una lipogenesi deregolata, a risposte di stress ossidativo e del RE e a un ampio spettro di fenotipi metabolici rilevanti per obesità, insulino‑resistenza e steatosi epatica. Queste funzioni si intrecciano anche con stati proliferativi e infiammatori, in cui il rimodellamento lipidico sostiene la crescita cellulare e l’adattamento allo stress.

SCD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCD senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

SCD Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCD nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCD, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di SCD. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCD nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da SCD nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via SCD nelle cellule tumorali con espressione di SCD silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.